文章信息
- 付晓芸, 唐雪, 李星影, 毕禄莎, 孙嘉茵, 徐小平
- FU Xiaoyun, TANG Xue, LI Xingying, BI Lusha, SUN Jiayin, XU Xiaoping
- 三叉神经节递质的UHPLC-MS/MS法测定
- Determination of trigeminal neurotransmitters by UHPLC-MS/MS
- 中国测试, 2019, 45(1): 64-69
- CHINA MEASUREMENT & TEST, 2019, 45(1): 64-69
- http://dx.doi.org/10.11857/j.issn.1674-5124.2018060032
2. 岛津企业管理(中国)有限公司成都分析中心,四川 成都 610063
2. Shimadzu (China) Co., Ltd., Chengdu Analysis Center, Chengdu 610063, China
生活中常说的“脸痛”即三叉神经痛(trigeminal nerve pain,TN),是一种反复发作在面部三叉神经分布区内的阵发性剧烈神经痛,是中枢系统常见病之一[1-2]。中枢神经系统内广泛分布大量的氨基酸,这类物质具有独特的神经递质作用,主要包括兴奋性氨基酸[3]如谷氨酸[4]、天冬氨酸和抑制性氨基酸
岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统;MTN-2008D氮吹仪(天津奥特塞恩斯仪器有限公司);KQ-500B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);R201B旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);HL104和XS205电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);Maxi Mix Ⅱ涡旋振荡器(赛默飞世尔科技有限公司);Milli-Q纯水仪(美国Milli-Q公司)。
甘氨酸(Gly)对照品,谷氨酸(Glu)对照品,
分别取Gly,GABA,Asp,Glu对照品适量,配制成质量浓度为0.1 mg/mL标准储备液,用超纯水逐级稀释至10,20,50,100,200,500,1 000,2 000,4 000 ng/mL,即为标准溶液。
1.2.2 内标溶液的配制取Glycine-N15适量,精密称定,超纯水配制成质量浓度20 μg/mL的内标溶液。
1.2.3 样品处理方法取三叉神经节组织称重,置于匀浆管中,精密加入生理盐水1 mL,匀浆后,吸取大鼠三叉神经组织匀浆液100 μL,加入20 μL内标工作液,再加入880 μL乙腈,涡旋1 min,14 000 r/min离心10 min,取上清液20 μL,进样LC-MS-MS,记录色谱图和质谱图,以质谱峰面积进行计算。
1.3 色谱条件的考察实验通过单因素考察,对色谱柱、流动相的比例、有机溶媒的极性和缓冲盐的强度等进行筛选。
1.3.1 色谱柱的选择流动相均以0.1%甲酸(FA)作为水相,含有0.1%FA的乙腈或甲醇为有机相,流量0.2 mL/min,以样品中主成分峰的保留时间(tR)、柱效(N)、拖尾因子(T)作为指标分别对色谱柱1#:HILIC柱(SepaxPolar-Silica,4.5 mm×150 mm,3 μm);色谱柱2#:五氟苯基柱(Ultimate PFP,2.1 mm×50 mm,3 μm);色谱柱3#:五氟苯基柱(Discovery HS F5-3, 2.1 mm×150 mm, 3.0 μm)进行考察。
1.3.2 有机相的选择选择1.3.1获得的最佳色谱柱,以0.1%甲酸(FA)作为水相,样品中以4个氨基酸峰的tR、N、T作为指标考察乙腈和甲醇对分离过程的影响。
1.3.3 缓冲盐浓度的选择选择1.3.1获得的最佳色谱柱,以0.1%甲酸(FA)作为水相,1.3.2项下最优的有机相,考察了0.1%FA溶液中添加不同浓度乙酸铵的影响。
1.4 色谱条件色谱柱:Discovery HS F5-3, 2.1 mm×150 mm,3.0 μm;流动相:A相为0.1%甲酸溶液,B相为0.1%甲酸-40%乙腈溶液;流量:0.20 mL/min;进样体积:2 μL;柱温:40 ℃;混合器体积:180 μL;洗脱方式:梯度洗脱,如表1所示。
1.5 质谱条件
采用+ESI离子化模式和多反应监测(MRM)扫描模式;碰撞气:氩气,270 kPa;接口温度:300 ℃;DL温度:250 ℃;加热模块温度:400 ℃;接口电压:4.0 kV;参数见表2。
氨基酸 | 前体
离子 |
产物
离子 |
Q1 Pre
Bias/V |
CE/
eV |
Q3 Pre
Bias/V |
甘氨酸 | 76.05 | 30.10* | –20.0 | –11.0 | –28.0 |
31.10 | –20.0 | –30.0 | –29.0 | ||
谷氨酸 | 148.05 | 84.10* | –10.0 | –16.0 | –19.0 |
56.10 | –10.0 | –27.0 | –10.0 | ||
天冬氨酸 | 134.05 | 70.05* | –17.0 | –17.0 | –13.0 |
88.10 | –15.0 | –13.0 | –10.0 | ||
|
104.05 | 87.15* | –11.0 | –15.0 | –10.0 |
69.10 | –26.0 | –17.0 | –12.0 | ||
甘氨酸-15N | 77.05 | 31.10 | –19.0 | –12.0 | –12.0 |
注:1)*代表定量离子对。 |
2 方法学验证 2.1 线性关系、检出限和定量限
取1.2.1中的标准溶液100 μL,加内标液制成质量浓度为1,2,5,10,20,50,100,200,400 ng/mL的标准曲线溶液,经测定计算各自线性方程,并经不断稀释检测出仪器的检出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)结果。
2.2 精密度和准确度以高中低3个浓度的AA混合标准溶液连续6次进样;以制备的高中低3组供试品溶液在同一日反复检测6次,于不同日测定,分别计算进样精密度、日内和日间精密度。精密量取大鼠三叉神经组织匀浆液80 μL,离心管,加内标液20 μL,加标准溶液20 μL,然后照1.2.3项下处理,制备高中低3个浓度的加标样品,按照1.4和1.5项下条件分析,测定加样回收率。
3 神经递质的检测 3.1 动物模型的选择以常见SD大鼠作为疼痛实验模型[15-16];体重:160~180 g。
3.2 三叉神经节中神经递质的检测实验设计了炎症0,1,3,5,7 d的大鼠模型,动物在全麻条件下取出三叉神经,每组8份样品,组织样品照1.2.3方法制备,照1.4和1.5项下测定条件检测。并使用SPSS软件进行配对样本T检验,以判断炎症0 d与炎症1,3,5,7 d数据是否具有统计学意义上的显著差异。
3.3 TGNs-SGCs细胞培养基中神经递质的检测本文利用TGNs-SGCs共培养体系,体外模拟验证Glu在炎症条件下的代谢变化。实验中取新鲜获取的三叉神经节,经木瓜蛋白酶溶液处理后加入 Neurobasal-A 培养基 2mL重悬混匀。用Matrigel 接种细胞悬液。置于 37°C、5% CO2的细胞培养箱中继续培养 24~48 h获得供试培养液。取供试培养液少许,照1.4,1.5项检测不同培养时间,培养液中Glu的含量变化。
4 结果讨论 4.1 液相色谱条件的选择色谱柱的选择由表3可知,在相应的较优的流动相条件下,五氟苯基柱(Discovery HS F5-3, 2.1 mm×150 mm, 3.0 μm)得到的评价指标更优,柱效更高,峰形对称度更好,更适合后续进行条件筛选。有机相的选择由表4可知,含40%的乙腈作为有机相,出峰情况好,柱效高。由表5可知,随着缓冲盐浓度的增加,离子强度上升,4种氨基酸的保留时间都随离子强度增大而减小,加入缓冲盐后对各种氨基酸的各项评价指标没有明显提升,故采用不加入缓冲盐的0.1%FA作为水相。
色谱柱 | 有机相组成 | 体积分数/
% |
Gly | GABA | Asp | Glu | |||||||||||
tR/min | N | T | tR/min | N | T | tR/min | N | T | tR/min | N | T | ||||||
1# | MeOH | 75 | 8.13 | 4 787 | 0.87 | 7.92 | 5 427 | 1.08 | 7.74 | 1 750 | 1.32 | 7.56 | 3 808 | 0.91 | |||
ACN | 70 | 4.85 | 2 904 | 0.82 | 4.79 | 4 078 | 0.94 | 4.63 | 787 | 1.32 | 4.54 | 2 283 | 0.79 | ||||
2# | ACN | 20 | 8.62 | 4 397 | 0.74 | 15.43 | 9 909 | 0.94 | 7.12 | 1 206 | 0.66 | 8.33 | 1 026 | 0.63 | |||
ACN | 40 | 10.75 | 15 094 | 1.09 | 21.09 | 8 593 | 0.88 | 8.47 | 6 207 | 1.54 | 10.22 | 11 573 | 1.19 | ||||
3# | ACN | 40 | 2.738 | 10 824 | 1.18 | 4.915 | 9 337 | 1.11 | 2.34 | 2 462 | 1.00 | 2.685 | 4 947 | 1.04 |
有机相组成* | 体积分数/
% |
Gly | GABA | Asp | Glu | |||||||||||
tR/min | N | T | tR/min | N | T | tR/min | N | T | tR/min | N | T | |||||
MeOH | 20 | − | − | − | 18.38 | 10 143 | 1.04 | 8.05 | 7 555 | 1.42 | 9.73 | 8 587 | 1.11 | |||
40 | − | − | − | − | − | − | 10.28 | 1 625 | 0.64 | 12.32 | 11 458 | 1.05 | ||||
ACN | 20 | 8.62 | 4 397 | 0.74 | 15.43 | 9 910 | 0.94 | 7.12 | 1 206 | 0.66 | 8.33 | 1 026 | 0.63 | |||
40 | 10.75 | 15 094 | 1.09 | 21.09 | 8 594 | 0.88 | 8.47 | 6 208 | 1.54 | 10.22 | 11 573 | 1.19 | ||||
注:1)“−” 表示该条件下未出峰;2)*:含0.1%FA的有机相。 |
水相* | Gly | GABA | Asp | Glu | |||||||||||
tR/min | N | T | tR/min | N | T | tR/min | N | T | tR/min | N | T | ||||
0.1%FA | 10.75 | 15 094 | 1.09 | 21.09 | 8 594 | 0.88 | 8.47 | 6 208 | 1.54 | 10.22 | 11 573 | 1.19 | |||
+10 μmol/L NH4Ac | 11.12 | 3 925 | 1.54 | 21.37 | 7 307 | 1.02 | 8.68 | 1 981 | 2.17 | 10.54 | 15 376 | 0.85 | |||
+100 μmol/L NH4Ac | 10.94 | 5 481 | 0.70 | 21.15 | 9 233 | 1.02 | 8.54 | 7 276 | 0.40 | 10.35 | 6 856 | 1.32 | |||
+1 mmol/L NH4Ac | − | − | − | 18.58 | 10 343 | 1.07 | 6.20 | 1 550 | 0.63 | 8.46 | 4 581 | 1.56 | |||
+5 mmol/L NH4Ac | 4.55 | 1 878 | 0.81 | 11.81 | 12 049 | 1.02 | 5.44 | 1 510 | 3.11 | 5.62 | 2 733 | 0.90 | |||
+20 mmol/L NH4Ac | − | − | − | 5.86 | 10 386 | 1.28 | − | − | − | 4.24 | 428 | 3.73 | |||
注:1)“−” 表示该条件下未出峰;2)*:水相以0.1%FA为基础,考察添加不同浓度NH4Ac的分离影响。 |
4.2 标准样品一级质谱图和二级质谱图
由1.5的质谱条件获得氨基酸各自相应的总离子流图,如图1所示。
4.3 方法学验证
由表6、表7可知,四种氨基酸在浓度范围内的线性关系良好(r2≥0.999),检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.14~1.23 ng/mL和0.47~4.11 ng/mL。比传统的氨基酸测定方法[17-18]的检测限、定量限更低,说明本实验采用的方法更灵敏高效。高中低3个不同浓度进样精密度、日内和日间精密度的RSD分别在0.90%~5.17%,3.01%~7.19%,4.64%~14.49%;加样回收率为94.8%~108%之间。
氨基酸 | 校准曲线 | 线性范围/(ng∙mL–1) | r2 | 检出限/(ng∙mL–1) | 定量限/(ng∙mL–1) |
Gly | Y=2.07×10–3X+8.83×10–3 | 1.00~400 | 0.999 8 | 0.141 | 0.470 |
Glu | Y=3.15×10–2X+4.68×10–3 | 1.00~400 | 0.999 8 | 0.145 | 0.484 |
Asp | Y=2.53×10–3X+0.65×10–3 | 5.00~400 | 0.999 6 | 1.232 | 4.106 |
GABA | Y=1.33×10–2X+0.62×10–3 | 1.00~400 | 0.999 8 | 0.158 | 0.525 |
氨基酸 | 浓度/
(μg∙mL–1) |
进样精密
度RSD/% |
日内RSD/
% |
日间RSD/
% |
回收率/
% |
Asp | 5 | 5.17 | 4.29 | 7.90 | 102 |
20 | 3.71 | 3.10 | 6.15 | 107 | |
100 | 2.46 | 3.34 | 5.35 | 97.3 | |
Glu | 5 | 2.31 | 4.43 | 12.60 | 106 |
20 | 1.18 | 3.79 | 7.11 | 108 | |
100 | 1.29 | 3.89 | 4.64 | 94.8 | |
Gly | 5 | 3.74 | 7.19 | 9.81 | 106 |
20 | 3.03 | 5.63 | 7.66 | 98.4 | |
100 | 1.95 | 6.59 | 8.83 | 99.4 | |
GABA | 5 | 2.74 | 3.49 | 14.49 | 96.9 |
20 | 0.90 | 3.27 | 8.16 | 108 | |
100 | 1.67 | 3.01 | 5.60 | 104 |
4.4 神经递质的检测
三叉神经节中神经递质的检测,由表8可知,4种氨基酸神经递质中天门冬氨酸(Asp)炎症模型中没有明显的变化(P>0.05),其余3种神经递质在炎症的1 d未表现出明显的变化外,在炎症3,5,7 d均表现出的显著变化(P<0.05)。由图2可知,疼痛过程中谷氨酸(Glu)的浓度在3 d后明显增高。甘氨酸(Gly)、
氨基酸 | 炎症时间 | ||||
0 | 1 d | 3 d | 5 d | 7 d | |
Gly | 0.073 2 | 0.068 7 | 0.133 8 | 0.134 1 | 0.136 7 |
Glu | 0.313 1 | 0.298 1 | 0.558 2 | 0.486 4 | 0.497 5 |
Asp | 0.204 1 | 0.179 4 | 0.306 3 | 0.262 4 | 0.272 0 |
GABA | 0.002 8 | 0.002 9 | 0.006 3 | 0.005 8 | 0.006 0 |
5 结束语
本文采用UHPLC-MS/MS法首次同时分离检测三叉神经节中4种氨基酸的含量。采用优化后的色谱条件,检测得到三叉神经节内Asp炎症 0 d与炎症 1,3,5,7 d没有统计学意义上的显著差异。Glu的浓度在炎症刺激3 d后明显增高,体外实验同样证实了Glu在炎症条件下的代谢变化。说明Glu的含量与疼痛异常行为密切相关,与炎症变化进展相符[19],另有研究发现中风、脑组织损伤、癫痫、帕金森病等病理过程突触间隙 Glu 含量都增高[20-21]。此外,Gly、GABA的浓度略有增加,说明两者作为抑制性的神经递质,在炎症下释放增加,抑制系统功能增强,但其具体机制还有待进一步的研究。
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