文章信息
- 黄亚, 宿怀予, 范秀, 周荣, 廖昌军
- HUANG Ya, SU Huaiyu, FAN Xiu, ZHOU Rong, LIAO Changjun
- 甘露饮中六种有效成分提取及含量测定
- Extraction and content determination of six effective components from Ganlu Yin
- 中国测试, 2019, 45(6): 81-87
- CHINA MEASUREMENT & TEST, 2019, 45(6): 81-87
- http://dx.doi.org/10.11857/j.issn.1674-5124.2018110040
-
文章历史
- 收稿日期: 2018-11-12
- 收到修改稿日期: 2018-12-20
2. 成都医学院药学院,四川 成都 610083
2. School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China
甘露饮出自《太平惠民和剂局方·卷六》,由生地黄、熟地黄、麦冬、天冬、石斛、枳壳、茵陈、黄芩、枇杷叶、甘草组成,具有滋阴生津,清热解毒,祛湿和中的功效[1],目前临床广泛用于放射性口腔炎、复发性口腔黏膜溃疡、慢性咽炎、慢性浅表性胃炎、湿热阳痿、角结膜干燥症等[2-3]。甘露饮中多种成分相辅相成、协同作用是其药理作用的重要基础,而各种潜在活性成分的含量与临床治疗效果密切相关。绿原酸是茵陈的有效成分之一,具有清除体内自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒和保肝利胆等作用[4]。麦角甾苷是地黄中苯乙醇苷类成分的代表。柚皮苷为枳壳中黄酮类成分之一,具有抗氧化、抗变态反应、抑制胃肠道平滑肌作用[5]。黄芩苷是黄芩的指标性成分,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌等药理作用[6-7]。甘草酸是甘草中最主要的活性成分,具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用[8]。熊果酸是枇杷叶中有效成分,具有保肝、消炎、抗肿瘤、调血脂、免疫双向调解等药理作用。在国内外研究中分别关于绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸的含量提取及测定方法有相关报道[9-15],而甘露饮中多种代表性活性成分的提取及同时定量,国内外尚未见文献报道。因此,本实验采用了正交试验法,以6种有效成分绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸的含量为指标,对甘露饮的提取工艺进行研究,优选出最佳提取工艺,同时建立了HPLC法测定6种有效成分的含量,为完善甘露饮质量评价标准和临床用药提供依据。
1 材料与仪器 1.1 仪 器1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);烘箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);XW-80A型旋涡混合器(上海青浦泸西仪器厂);旋转蒸发仪(德国IKA);CP225D型电子天平(德国赛多利斯公司);粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)。
1.2 材 料每批甘露饮处方药材包括生地黄15 g、熟地黄15 g、麦冬15 g、天冬15 g、石斛15 g、枳壳10 g、茵陈10 g、黄芩10 g、枇杷叶10 g、甘草6 g(均购自四川博仁药业有限公司,批号分别为171001,180201,180401,180301,171001,180101,180401,180302,180301,180201,均符合2010年版《中国药典》和《卫生部药品标准》有关规定);绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸对照品(成都植标化纯生物技术有限公司,批号分别为180302,180213,180119,180221,180105,180626,纯度均≥99%);甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher),磷酸为色谱纯(成都市科隆化学试剂有限公司),乙醇为分析纯,水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件Syncronis C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相乙腈(A)- 0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0~5 min,5% A;5~40 min,5%~20% A;40~60 min,20%~50% A;60~80 min,50%~90% A;80~90.1 min,90%~5% A;90.1~100 min,5% A),流量1.0 mL/min,柱温35 ℃,检测波长210 nm,进样量20 μL。
2.2 混合对照品溶液制备精密称取绿原酸对照品5.0 mg,麦角甾苷对照品5.0 mg,柚皮苷对照品40.0 mg,甘草酸对照品10.0 mg,用70%乙腈定容至10 mL。精密称取黄芩苷对照品10.0 mg,熊果酸对照品5.0 mg,用甲醇定容至5 mL量瓶中,作为单个对照品贮备液,分别吸取上述6种单个对照品贮备液1.6,2.0,1.0,2.5,1.0,1.2 mL于10 mL量瓶中,70%乙腈定容至刻度,即得绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸(质量浓度分别为80,100,400,500,100,60 μg·mL−1)混合对照品贮备液,冷藏备用。
2.3 供试品溶液制备按处方量称取相应量的甘露饮中药材,粉碎过10目筛。称取甘露饮粗粉,用60%乙醇提取,料液比1∶4,提取时间为1 h,提取次数为1次,旋转蒸发仪浓缩至粘稠状后,烘干得浸膏。精密称取浸膏0.1 g,加入70%乙腈定容至10 mL,即得。
2.4 系统适应性实验分别取混合对照品溶液和供试品溶液按2.1项下色谱条件测定,结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸及熊果酸的保留时间分别为14.2,25.8,27.8,32.7,51.3,74.7 min,供试品中其他成分不干扰样品测定,如图1所示。
2.5 线性关系考察
精密吸取2.2项混合对照品贮备液0.3,0.75,1.5,3,4 mL定容至5 mL量瓶中,70%乙腈稀释至刻度,即得系列浓度的对照品溶液,取混合对照品贮备液和系列浓度的对照品溶液按2.1项下色谱条件测定,以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,绘制标准曲线,结果见表1,可知6种有效成分在一定质量浓度范围内线性关系良好。
成分 | 回归方程 | r2 | 线性范围/( μg·mL−1) |
绿原酸 | Y=37.435 X+44.729 | 0.999 5 | 4.80~80.00 |
麦角甾苷 | Y=26.1 X−223.06 | 0.999 7 | 10.00~100.00 |
柚皮苷 | Y=60.413 X−418.45 | 0.999 6 | 24.00~400.00 |
黄芩苷 | Y=86.057 X−1 332 | 0.999 7 | 30.00~500.00 |
甘草酸 | Y=2.7334 X−4.157 2 | 0.999 5 | 6.00~100.00 |
熊果酸 | Y=7.032 X−12.341 | 0.999 5 | 3.60~60.00 |
2.6 精密度实验
精密吸取2.2项混合对照品溶液4 mL至5 mL量瓶中,70%乙腈定容至刻度,按2.1项下色谱条件连续进样5次,结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.67%,2.89%,0.18%,0.21%,0.33%,1.19%,表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性实验按处方量称取相应量的甘露饮中药材,按2.3项方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件分别于0,3,6,9,12,24 h测定,结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸峰面积的RSD分别为3.00%,2.87%,1.60%,0.84%,3.23%,0.98%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 重复性实验按处方量称取相应量的甘露饮中药材,共6份,按2.3项方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件测定,结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸峰面积的RSD分别为1.89%,2.67%,1.08%,0.24%,2.64%,3.01%,表明该方法重复性良好。
2.9 加样回收试验精密称取甘露饮浸膏0.05 g,共9份,分别置于9个5 mL量瓶中,用70%乙腈定容,分别按已知含有量的80%、100%、120% 3个水平加入混合对照品溶液,每个水平3份,按2.1项下色谱条件测定,计算回收率,见表2。结果绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸的加样回收率平均值在96.12%~101.82%,RSD在1.72%~2.92%。表明该方法回收率良好。
成分 | 原有量/ μg | 加入量/ μg | 测得量/ μg | 回收率/% | 平均值/% | RSD/% |
绿原酸 | 43.475 7 | 35 | 78.231 | 99.69 | 99.81 | 2.92 |
45.214 7 | 35 | 85.340 9 | 106.39 | |||
44.345 2 | 35 | 78.778 1 | 99.29 | |||
45.214 7 | 43.5 | 88.318 6 | 99.55 | |||
45.214 7 | 43.5 | 89.705 1 | 101.12 | |||
46.084 2 | 43.5 | 88.102 3 | 98.35 | |||
44.345 2 | 52 | 95.062 5 | 98.67 | |||
46.084 2 | 52 | 97.904 5 | 99.82 | |||
44.345 2 | 52 | 91.920 6 | 95.41 | |||
麦角甾苷 | 51.705 6 | 43 | 94.769 | 100.07 | 96.12 | 1.92 |
54.173 8 | 43 | 93.566 5 | 96.29 | |||
52.939 7 | 43 | 90.210 6 | 94.03 | |||
54.173 8 | 53.5 | 103.534 9 | 96.16 | |||
54.173 8 | 53.5 | 103.112 8 | 95.76 | |||
55.407 9 | 53.5 | 103.121 5 | 94.69 | |||
52.939 7 | 64.5 | 113.06 | 96.27 | |||
55.407 9 | 64.5 | 112.723 | 94.01 | |||
52.939 7 | 64.5 | 114.848 6 | 97.79 | |||
柚皮苷 | 808.146 2 | 645 | 1491.984 3 | 102.67 | 99.72 | 2.16 |
840.472 1 | 645 | 1477.808 4 | 99.48 | |||
824.309 2 | 645 | 1416.175 5 | 96.38 | |||
840.472 1 | 807.5 | 1 681.585 | 102.04 | |||
840.4721 | 807.5 | 1 610.9432 | 97.75 | |||
856.635 | 807.5 | 1 681.295 5 | 101.03 | |||
824.309 2 | 970 | 1 808.878 2 | 100.81 | |||
856.635 | 970 | 1 824.334 2 | 99.87 | |||
824.309 2 | 970 | 1 748.241 3 | 97.43 | |||
黄芩苷 | 1 208.669 8 | 965 | 2 161.218 7 | 99.43 | 99.11 | 2.74 |
1 257.016 6 | 965 | 2 197.892 1 | 98.91 | |||
1 232.843 2 | 965 | 2 251.155 6 | 102.43 | |||
1 257.016 6 | 1 207.5 | 2 407.137 1 | 97.67 | |||
1 257.016 6 | 1 207.5 | 2 545.890 5 | 103.30 | |||
1 281.19 | 1 207.5 | 2 451.340 4 | 98.50 | |||
1 232.843 2 | 1 450 | 2 661.224 5 | 99.19 | |||
1 281.19 | 1 450 | 2 560.050 9 | 93.73 | |||
1 232.843 2 | 1 450 | 2 650.197 | 98.78 | |||
甘草酸 | 42.639 2 | 34 | 73.518 9 | 95.93 | 99.28 | 2.83 |
44.344 7 | 34 | 77.336 | 98.71 | |||
43.491 9 | 34 | 79.466 | 102.55 | |||
44.344 7 | 42.5 | 86.584 3 | 99.70 | |||
44.344 7 | 42.5 | 83.133 8 | 95.73 | |||
45.197 5 | 42.5 | 88.831 1 | 101.29 | |||
43.491 9 | 51 | 92.404 6 | 97.79 | |||
45.197 5 | 51 | 99.927 8 | 103.88 | |||
43.491 9 | 51 | 92.531 6 | 97.93 | |||
熊果酸 | 32.642 1 | 26 | 60.313 8 | 102.85 | 101.82 | 1.72 |
33.947 8 | 26 | 60.480 8 | 100.89 | |||
33.294 9 | 26 | 60.878 3 | 102.67 | |||
33.947 8 | 32.5 | 68.911 7 | 103.71 | |||
33.947 8 | 32.5 | 65.548 7 | 98.65 | |||
34.600 6 | 32.5 | 66.950 2 | 99.78 | |||
33.294 9 | 39 | 74.756 4 | 103.40 | |||
34.600 6 | 39 | 74.851 4 | 101.70 | |||
33.294 9 | 39 | 74.243 8 | 102.70 |
2.10 甘露饮提取工艺优化 2.10.1 提取溶剂的选择
按处方量称取相应量的甘露饮中药材,粉碎过10目筛。称取甘露饮粗粉,分别采用纯水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各500 mL,连续提取2次,每次2 h,提取液旋转蒸发浓缩后喷雾干燥。分别取干燥后粉末0.1 g,加入70%乙腈定容至10 mL,按2.1项色谱条件分别测定干粉中绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸、熊果酸含量。结果表明60%乙醇为提取溶剂所得干粉中六种有效成分含量均较高,本试验选择60%乙醇作为提取溶剂,进行正交试验优化工艺研究。
2.10.2 正交试验设计根据前期预实验结果,选择料液比、提取时间、提取次数为影响因素,实验因素水平见表3。每个因素选择3个水平进行L9(34)正交试验设计,以甘露饮中绿原酸、麦角甾苷、柚皮苷、黄芩苷、甘草酸和熊果酸的提取率作为评价指标,按2.1项下色谱条件测定提取干燥后样品中6种有效成分峰面积,计算提取率,实验设计方案与结果见表4,方差分析见表5。提取率=样品峰面积/标准品峰面积×100%。
序号 | 料液比/(mL·g−1) | 提取时间/h | 提取次数/次 | 提取率/% | |||||
绿原酸 | 麦角甾苷 | 柚皮苷 | 黄芩苷 | 甘草酸 | 熊果酸 | ||||
1 | 1∶4 | 1 | 1 | 35.82 | 37.49 | 148.55 | 208.57 | 45.00 | 75.51 |
2 | 1∶4 | 2 | 2 | 28.55 | 24.46 | 134.31 | 184.56 | 41.36 | 28.24 |
3 | 1∶4 | 3 | 3 | 23.83 | 23.67 | 125.41 | 174.23 | 47.93 | 49.46 |
4 | 1∶8 | 1 | 2 | 29.59 | 16.25 | 138.00 | 162.19 | 104.96 | 39.35 |
5 | 1∶8 | 2 | 3 | 25.72 | 13.49 | 107.32 | 169.68 | 33.91 | 39.83 |
6 | 1∶8 | 3 | 1 | 26.01 | 11.30 | 106.16 | 173.17 | 24.16 | 30.57 |
7 | 1∶12 | 1 | 3 | 28.3 | 26.41 | 124.26 | 191.33 | 95.61 | 51.19 |
8 | 1∶12 | 2 | 1 | 31.26 | 37.16 | 132.06 | 190.85 | 94.91 | 32.98 |
9 | 1∶12 | 3 | 2 | 24.06 | 10.04 | 101.04 | 160.31 | 24.04 | 20.06 |
成分 | 因素 | SS | df | MS | F | P |
1 | 8.178 | 2 | 4.089 | 1.000 | >0.05 | |
绿原酸 | 2 | 66.067 | 2 | 33.034 | 8.079 | >0.05 |
3 | 227.266 | 2 | 113.633 | 27.790 | <0.05 | |
误差 | 8.178 | 2 | 4.089 | |||
1 | 354.713 | 2 | 177.357 | 1.676 | >0.05 | |
麦角甾苷 | 2 | 240.692 | 2 | 120.346 | 1.138 | >0.05 |
3 | 211.584 | 2 | 105.792 | 1.000 | >0.05 | |
误差 | 211.584 | 2 | 105.792 | |||
1 | 656.089 | 2 | 328.045 | 1.272 | >0.05 | |
黄芩苷 | 2 | 515.939 | 2 | 257.969 | 1.000 | >0.05 |
3 | 3 270.988 | 2 | 1 635.494 | 6.340 | >0.05 | |
误差 | 515.939 | 2 | 257.969 | |||
1 | 650.167 | 2 | 325.084 | 0.637 | >0.05 | |
柚皮苷 | 2 | 1 020.078 | 2 | 510.039 | 6.879 | >0.05 |
3 | 148.288 | 2 | 74.144 | 1.000 | >0.05 | |
误差 | 148.288 | 2 | 74.144 | |||
1 | 1 102.733 | 2 | 551.367 | 36.914 | <0.05 | |
甘草酸 | 2 | 3 722.152 | 2 | 1 861.076 | 124.599 | <0.01 |
3 | 29.873 | 2 | 14.936 | 1.000 | >0.05 | |
误差 | 29.873 | 2 | 14.936 | |||
1 | 479.809 | 2 | 239.905 | 1.000 | >0.05 | |
熊果酸 | 2 | 952.960 | 2 | 476.480 | 1.986 | >0.05 |
3 | 604.001 | 2 | 302.001 | 1.259 | >0.05 | |
误差 | 479.809 | 2 | 239.905 | |||
注:1)F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99。 |
由表4可知序号1效果最优,得到最优条件是料液比1∶4、提取时间1 h、提取次数1次。方差分析结果表明提取时间对熊果酸、甘草酸、柚皮苷、绿原酸的提取含量影响显著;黄芩苷的提取含量受料液比、提取时间、提取次数的影响相当;提取时间、提取次数对麦角甾苷的提取含量影响不显著。料液比、提取时间对甘草酸的提取含量有显著影响:料液比1∶8、提取时间为1 h得到甘草酸含量最多,即序号4为最优;提取次数对绿原酸含量有显著影响:提取次数为1次,绿原酸含量最多,即第3因素下1水平为最优方法。液料比、提取时间、提取次数对熊果酸、黄芩苷、柚皮苷、麦角甾苷提取含量影响并不显著。
综合以上实验结果,最佳提取工艺条件是:甘露饮提取溶剂为60%乙醇,料液比1∶4、提取时间为1 h、提取次数为1次。
2.10.3 验证试验根据正交实验筛选出来的最佳提取工艺制备3批喷雾干燥供试品,按2.1项下色谱条件进行测定,结果3批供试品中绿原酸平均含量为8.56 μg/g(RSD=2.52%);麦角甾苷平均含量为16.85 μg/g(RSD=2.88%);黄芩苷平均含量为266.46 μg/g(RSD=2.65%);柚皮苷平均含量为173.86 μg/g(RSD=2.08%),甘草酸平均含量为14.33 μg/g(RSD=2.52%),熊果酸平均含量为14.85 μg/g(RSD=3.00%)。6种有效成分含量RSD均在3%以内,表明工艺稳定可行。
3 结束语试验考察了甲醇、乙腈、缓冲盐种类和浓度对样品分离的影响,最后确认乙腈和0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱后,各色谱峰分离度好,保留时间适中,基线稳定,绿原酸、黄芩苷、甘草酸和熊果酸峰型和分离度均较好,而麦角甾苷与柚皮苷由于自身化学性质和方剂中含量差异的影响,能实现基线分离。经过方法学考察试验,本文建立的含量检测方法准确、可靠,重复性好,可用于同时测定甘露饮中多种物质的含量,为甘露饮质量控制及综合评价提供了借鉴。
[1] |
宋. 太平惠民和剂局编. 太平惠民和剂局方[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1985: 308.
|
[2] |
路军章, 张蕾. 中医药防治急性放射性食管炎[J].
中华中医药杂志, 2012, 27(12): 3019-3022.
|
[3] |
罗素芳. 甘露饮加减在阴虚湿热证型角结膜干燥症治疗中的疗效观察[J].
中医临床研究, 2017, 9(32): 113-114.
DOI:10.3969/j.issn.1674-7860.2017.32.056 |
[4] |
严永旺, 肖兰, 周旭, 等. 绿原酸的药理作用及药用研发对策[J].
中国药房, 2017, 28(19): 2729-2732.
DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.36 |
[5] |
金元宝, 刘萍, 刘小根, 等. 柚皮苷的生物活性研究进展[J].
中国现代医药杂志, 2018, 20(3): 92-97.
DOI:10.3969/j.issn.1672-9463.2018.03.034 |
[6] |
XU L, LI J, ZHANG Y, et al. Regulatory effect of baicalin on the imbalance of Th17 /Treg responses in mice with allergic asthma[J].
Journal of Ethnopharmacology, 2017, 208: 199-206.
DOI:10.1016/j.jep.2017.07.013 |
[7] |
周红潮, 杜锐, 王慧, 等. 黄芩苷药代动力学研究进展[J].
中国中药杂志, 2018, 43(4): 684-688.
|
[8] |
万嘉洋, 张宇燕, 黄平, 等. 甘草中甘草酸的粗提工艺研究[J].
中华中医药学刊, 2017, 35(1): 149-151.
|
[9] |
王韵, 赵亮, 柴逸峰, 等. RP-HPLC法同时测定茵陈蒿汤中14个成分[J].
药物分析杂志, 2017, 37(3): 393-401.
|
[10] |
林鹏. RP-HPLC法同时测定生地黄中麦角甾苷和马替诺皂苷的含量[J].
医学影像与检验, 2017, 4(14): 273.
|
[11] |
邓桂珠, 蓝文煜, 窦佩丹, 等. 枳壳及其炮制品色差值与化学成分的相关性[J].
中成药, 2017, 39(6): 1228-1231.
DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2017.06.025 |
[12] |
于东平. 甘露饮合剂的制备与质量控制[J].
中国中医药咨询, 2011, 3(15): 375-376.
|
[13] |
夏雪, 王溪晓, 任国庆, 等. 26批不同来源枳壳中成分柚皮苷与橙皮苷及新橙皮苷含量分析[J].
亚太传统医药, 2018, 14(6): 58-60.
|
[14] |
刘慧妍, 黄馨慧, 张艳海. HPLC法快速测定8种中药中齐墩果酸和熊果酸[J].
中草药, 2017, 48(10): 1998-2001.
DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2017.10.011 |
[15] |
周倩, 戴衍朋, 王亮, 等. HPLC法测定生甘草、炙甘草中6种成分[J].
中成药, 2016, 38(2): 378-382.
|